BIO-RAD CFX Maestro(定量PCR数据处理大师)

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　　软件应用

　　背景简介：

　　肌萎缩性脊髓侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS），俗称“渐冻人”，是一种运动神经元疾病，病人表现出因上运动神经元和下运动神经元变性所致的肌无力、肌萎缩等症状。为研究其是否存在细胞自噬的病理，研究者将ALS患者和其他非ALS类型包括包涵体肌炎（inclusion body myositis，IBM，一种慢性炎症性肌病）样本等进行比较。观察ALS病理的一种已知标志物磷酸化TAR DNA结合蛋白43（pTDP-43）以及调节细胞自噬的P62蛋白的特异性表达情况。除用到免疫组化、免疫荧光的方法外，研究人员也对这两种蛋白对应的基因TARDBP 和SQSTM1 进行了qPCR实验分析比较，以下是具体的过程。

　　样本设置：

　　ALS样本组——ALS1-ALS5共5个生物学重复；

　　IBM样本组——IBM1-IBM3共3个生物学重复；

　　阴性对照组——MSC1-MSC3共3个轻微神经源性肌萎缩样本生物学重复；

　　空白对照——1个无模板对照

　　基因设置：

　　2个目的基因——TARDBP，SQSTM1；

　　2个参考基因——GAPDH，RPS18；

　　所用到的染料法引物对均来自于Bio-Rad提供的PrimePCR Assay。

　　板面布局：

　　12个样本×4个基因，1个96孔板做2个重复，共做2个96孔板（即2个批次实验，各4个技术学重复）。

　　数据分析方法：

　　将TARDBP 和SQSTM1 表达用两个参考基因（GAPDH，RPS18）进行均一化，两组患者分别与对照组进行相对均一化基因表达比较，显著性检验采用非配对t 检验。